配制磷酸盐缓冲液时,通常所说的浓度0.01m指的是缓冲溶液中所有的磷酸根浓度,而非na+或k+的浓度,na+或k+的作用是调节渗透压。
各种浓度pb(ph=7.4)的配制:
先配0.2m pb(ph=7.4,100ml):取0.2 mol/l的na2hpo4母液81ml及0.2mol/l的nah2po4母液19ml,混匀。然后只需将0.2m pb(ph=7.4)按相应比例
适当稀释即可,如:
0.1m pb(ph=7.4):取500ml 0.2m pb,加水稀释至1l。
0.01m pb(ph=7.4):取50ml 0.2m pb,加水稀释至1l。
0.02m pb(ph=7.4):取100ml 0.2m pb,加水稀释至1l。
以上配制方法可供参考。日常配制流动相时常使用缓冲盐搭配酸/碱溶液进行ph调节。
在使用酸/碱溶液调节缓冲溶液的ph时,使用低浓度(0.1mol/l)比使用高浓度(1mol/l)引起的误差更小,对缓冲溶液ph的重复性和分析结果的重现性更有优势,尤其是针对一些对ph敏感的分析项目。
应用案例:
客户反馈参考应用报告的液相条件,同一台液相,不同天配制的流动相,配制方式一样,分离重现性不好,有时能分开,有时会重合无法分离。了解到客户称取磷酸盐后溶于1l超纯水中后,再滴加1mol/l碱溶液进行ph调节。此方法容易造成配制差异,引起峰分离情况差异。
优化流动相配制方法:
① 精密称取mg±0.001g磷酸盐,溶于约800ml超纯水中溶解。
② 预先配制0.1mol/l氢氧化钠/氢氧化钾溶液,称样量ng±0.001g,用量筒准确量取100ml碱溶液备用。
③ 将量取的碱溶液缓慢加入已溶解的磷酸盐溶液中,观察ph变化,达到目标ph后,停止加入碱溶液,记录所需碱溶液体积。
④ 再在缓冲盐溶液中加入超纯水定容至1l。
⑤ 后续配制只需量取固定体积的碱溶液加入固定称样量的缓冲溶液中,即可达到固定的ph。成功减小流动相配制差异,提高峰分离重现性。
效果见下图:
结论:
流动相ph的稳定性与准确性对样品分析的影响较大时,需尽量规避流动相配制时的人员误差,环境误差,仪器误差,物料称量误差等,以保证方法分析效果的重现性。